核酸检测原理
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概述

随着新冠疫情的发展,核酸检测进入千家万户,似乎大部分人对于他的映像只停留在判断阳不阳的利器,究其原理却鲜少人知。心血来潮,在知乎查阅了相关介绍,记录在这里用作备忘。

核酸

核酸是在高中生物便学过的知识,根据组成元素可以分为两种,一种为脱氧核糖核酸(dna),另一种为核糖核酸(rna),字面意思理解DNA便是少了一份氧元素。

浅浅放一个相关介绍,两者皆为遗传物质,DNA为主,RNA为辅,但也不乏RNA遗传的病毒,许多冠状病毒便是如此。所以病毒核酸检测,其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。而针对病毒RNA进行检测的技术,还可以分两种:一种是实时荧光RT-PCR,一种是病原宏基因组测序(mNGS)。它们都是用于诊断新冠病毒感染的方法。但核酸检测因为速度快(4~6小时)而应用更多,而基因测序比较慢(24~72小时),所以用的比较少。一般对于高度疑似新冠病毒感染、但核酸检测是阴性的病人,会利用基因测序技术进一步确认。

实时荧光RT-PCR检测

首先要采集样本。由于新冠病毒是通过呼吸道感染人体,所以样本要从呼吸道采集。目前常规的样本类型大致有2类:一类是用咽拭子、鼻拭子在人的上呼吸道(咽部或鼻腔)擦拭采集;另一类是收集下呼吸道痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。
采集到的样本将被严格封存,送到实验室。那里是检测员让病毒“现形”的战场。

  1. 提取RNA在样本中加入核酸提取试剂,把病毒破坏,让核酸释放出来。
  2. 把病毒RNA“反转录”成cDNA用核酸检测试剂盒中的“逆转录酶”通过逆转录技术(RT),把病毒的RNA“反转”成一种特异DNA,即cDNA(因为病毒RNA结构不稳定,所以把病毒RNA转换成稳定的cDNA会更方便检测)。完成转录后,所有工作都将围绕cDNA展开。
  3. 进行cDNA的扩增与检测扩增cDNA的数量。这里应用的就是PCR,全称聚合酶链式反应。具体来说,就是借助试剂盒中一些特殊物质,让cDNA不断复制,使其数量呈指数式增长。所谓RT-PCR,就是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的扩增(PCR)相结合的技术。当cDNA扩增的同时,试剂盒中还有一种叫荧光探针的东西同时工作。它会释放荧光信号,cDNA每完成一次扩增,荧光信号就会增加一点,而PCR检测仪就能记录到一个荧光信号增加的Ct值。
  4. 结果检测这一步就是根据检测仪记录的Ct值,进行检测结果分析。理想状态下,如果样本中有新冠病毒,那么在cDNA完成预订次数的扩增后,检测仪记录的Ct值就会形成一个逐渐上升的S形曲线,检测结果为阳性;如果没有类似的S型曲线,检测结果就为阴性。
    做完以上所有工作,通常需要4~6小时。

    基因测序技术

    病原宏基因组测序(mNGS),是针对病原微生物(细菌、真菌、病毒和寄生虫等)使用的基因测序技术。它的原理就比较简单了。首先,我们要掌握病毒的基因序列。然后是检测。在实验室里,技术人员利用基因测序仪器,针对样本中提取的病毒RNA或总核酸进行检测。当样本中检测出的病毒基因序列,与已知的新冠病毒基因序列高度同源,就可以确诊感染。
    基因测序是一个更加复杂且耗时的过程,可以简单归纳为以下7个步骤:
    1.采集样本
    2.从样本中提取出病毒RNA
    3.把病毒RNA反转录为cDNA为了便于检测,测序也需要进行反转录。
    4.文库构建翻译过来,就是把完整的DNA链条打碎成片段,接着给DNA片段末端修复,然后给DNA片段加上独有的样本编码(用于识别这个样本是谁的),并把DNA片段用一个接头固定起来,方便测序……
    5.高通量测序通过高通量测序仪,把文库的核酸序列检测出来。
    6.生物信息分析把测出的DNA序列与已有的数据库进行比对。
    7.出具检测报告
    这样一套完整的病毒基因测序流程,加上出结果,通常需要24~72小时。基因测序还有个特异功能:如果病人同时感染了多种病毒,基因测序也能够发现。

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